泰昌元年（1620年）九月，光宗驾崩。李选侍仍然居住在乾清宫，还强迫皇长子朱由校封她为皇太后。左光斗上疏说：“内廷的乾清宫，好比是外廷的皇极殿，只有天子控制上天才能够居住，只有皇后作为天子的配偶才能一起居住在那里。其余的嫔妃虽然先后与皇帝同居过但不能长期居住，不仅是为了避嫌，而且是为了区别尊卑的秩序。李选侍既不是皇帝原配，又不是皇太子的亲生母亲，却堂而皇之地居住在正宫里面，而让殿下退出来居住慈庆宫，不能够举行国宴，实行国家大礼，在名份上怎么说得过去？李选侍服侍先皇帝没有脱去发簪请罪告诫皇上的美德，对于殿下没有照看养育的恩情，这样一个人，难道可以把皇帝托付给她吗？况且皇帝已经有十六岁了，内有忠诚正直、老成持重的大臣辅佐，外有公卿大臣的辅助，何必担心没有人，还要人喝奶，像个婴孩背在身上吗？况且皇帝新登基，正应该不被人牵制，何必一定要交给一个妇人之手呢？到现在还不早做决断，将来会被她借抚养的名义，实行专制统治，武则天的祸害今天再现，将来的人又怎么说。”李选侍见到左光斗的奏疏后，大为恼怒，数次召见他。左光斗说：“我是天子的命官，不是天子宣召我就不去。你们是为谁宣召我呢？”
天启元年（1621年），左光斗再次晋升为左佥都御史。这时，韩戈广、赵南星、高攀龙、杨涟、郑三俊、李邦华、魏大中诸人都身居要职，左光斗与他们志同道合，遇事大胆直言，严厉考核人物，区别流品，正直的人都依靠他们，而忌恨他的人都不能相容。 天启元年（1621年），左光斗领直隶屯田事，他亲自考察全境，目睹荒原横亘数十里，地势高的地方长满荒草，洼地成为泥沼的荒凉景象，忧心如焚，便任卢象观为通判，主持水利。左光斗出京掌管屯田事宜后说过：“北方人不知道兴修水利，一年地就荒了，二年老百姓就往外地迁徙，三年就土地全荒，老百姓也走光了。现在要想旱不成灾，涝不成害，只有兴修水利一个途径。”于是，他奏上三因十四议：一因天时，二因地利，三因人情。一议浚通河流，二议挖渠，三议引水，四议修坝，五议建闸，六议设坡，七议地势，八议筑塘，九议招徕百姓，十议选人，十一议选将，十二议兵屯，十三议种田赋额，十四议富民可以拜爵。他还写了《足饷无过屯田，屯田无过水利疏》，提出北方应效仿南方，兴修水利，开荒屯田，引进种植水稻等措施。由于左光斗的极力倡导和躬亲力行，法度井井有条，诏令全部实行，当时京城所辖地区水利得到大规模兴修，北方人也才开始种稻。 邹元标曾说：“三十年前，京师人不知道稻草为何物，现在到处都种稻，农民感受到了种水田的收获。”
天启三年（1623年）三月，左光斗升授大理寺左寺丞。
天启四年（1624年）六月，由于宦官魏忠贤专权，杨涟上了一份奏章，揭发魏忠贤二十四条罪状。左光斗等七十余人大力支持，弹劾忠贤等三十二斩罪，但熹宗皆不信。
天启五年七月二十六日（1625年8月30日），左光斗在牢中遇害，享年五十一岁。
天启七年（1627年），明熹宗驾崩，明思宗即位，改元崇祯，惩办阉党，魏忠贤畏罪自杀，思宗追赠光斗右都御史、太子少保，录用其一子为官。 南明弘光时，左光斗追谥忠毅。
